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分子植物育种
(
网络版
)
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online)
1209
速
)
，凝胶至少
10 min
。
4.2.3
上样电泳
将准备好的
RNA
样品取出，置于冰上，待融
化后每个样品中加入
3 μL 6× Loading Dye
和
2 μL
RNA
上样缓冲液，混匀，瞬时离心；
95
℃金属浴中
变性
5 min
；上样，并上
3 μL 10 bp DNA Ladder
(Fermentas)
作为
Marker
，
100 V
电泳约
1.5 h
。
4.2.4
切胶
在紫外凝胶成像仪中拍照后，在胶上包含
10 bp
DNA Ladder 10 bp~150 bp
的区域，切出约
5cm ×
5cm
的方形胶。
4.2.5
转膜
裁
5cm ×5cm
的
3M
滤纸
6
张、尼龙膜
1
张，
在
1× TAE
缓冲液中浸泡
5 min
；将
3
张已浸湿的
3M
滤纸一层一层铺在半干电转仪的平板上，在滤
纸上铺上尼龙膜，将胶有
RNA(
背离胶孔
)
的一面朝
下置于尼龙膜上，再将剩下的
3
张滤纸层层叠加铺
在胶上，做成“三明治”，然后用玻璃棒在上面滚
动，尽可能地赶走气泡
,
可再添加一些
TAE
缓冲液
使其更加湿润。盖上电转仪盖子，以恒定电流
100
mA (
约
3.3 mA•cm
-2
)
转膜约
1 h
。
转膜结束后，可用铅笔在膜上标记有
RNA
的
那一面，并用剪刀剪掉一角以标记相对位置。将转
膜后的胶拍照，确认目的条带所在位置的所有
RNA
被转到了尼龙膜上。
4.2.6
交联
在膜还是湿润的时候，置于紫外凝胶成像仪中
打开紫外灯，曝光
30 s
；然后将尼龙膜夹在两层干
净的滤纸之间，
80
℃烘烤
30 min
，使
RNA
完全固
定在膜上。将膜储存在洁净密封袋中备用。
4.2.7
预杂交
将
Northern
杂交液
37
℃预热；准备杂交袋；
将鲑精
DNA(100 μg•mL
-1
)
在
95
℃变性
5 min
后置于
冰上。将交联后的尼龙膜放进杂交袋中，量取
10 mL
Northern
杂交液，再加入
5 μL
鲑精
DNA
，混匀后
加入杂交袋中，尽可能地挤尽袋中的气泡，封口；
将杂交袋置于
50
℃水浴摇床中振荡孵育
1 h
。
4.2.8
杂交
取
5 μg•μL
-1
探针
10 μL
加入杂交袋中，挤气
泡，封口；
42
℃
水浴，振荡孵育
16 h (
过夜
)
。
4.2.9
洗膜、曝光
杂交完毕后，从杂交袋中取出尼龙膜，将有
RNA
的一面向上置于
Washing I
溶液中，室温振荡
5 min;
再将膜置于
Washing II
溶液中，室温振荡
30 min
；然后将膜置于
1×Washing Buffer
中，室温
振荡
5 min
；将膜放入杂交袋中，加入
10 mL 1×
Blocking Buffer
，挤气泡，封口，室温振荡
30 min
。
取
1 μLAnti-digoxigenin-AP
加入杂交袋中，挤
气泡，封口，室温振荡
45 min
；将膜置于
1×Washing
Buffer
中室温振荡
15 min
，重复该步骤一次；将膜
置于
1×Detection Buffer
中平衡
2~5 min
。
将洗涤完毕的尼龙膜置于洁净透明的杂交袋
中；取
5 μL CDP-star
加入
500 μL 1× Detection
Buffer
中混匀，然后加入杂交袋中，去除气泡，黑
暗条件下显色
5 min
。将杂交袋夹在吸水纸中间吸
去多余的显色液，然后将装有膜的杂交袋放入暗盒
中，在膜上压上
X
光片，盖好暗盒，曝光约
1 h
。
X
光片显影和定影，观察杂交结果。
4.2.10 X
光片扫描及灰度值计算
用扫描仪将定影后的
X
光片扫描，然后用
ImageJ
软件进行背景消除、调整亮度和对比度等处
理后测出条带的灰度值；将
miRNA
条带灰度值除
以内标条带的灰度值得到的比值作为比较
miRNA
表达量的依据。
作者贡献
周波是本研究的实验设计和实验研究的执行人；范鹏珍
完成数据分析、论文初稿的写作；周波参与实验设计、试验
结果分析；周波是项目的构思者及负责人，李玉花指导实验
设计、数据分析、论文写作与修改。全体作者都阅读并同意
最终的文本。
致谢
本研 究由中央 高校基本 科研业务 费专项资 金
(DL11CA03)
资助。
参考文献
Ambros V., Bartel B., Bartel D.P., Burge C.B., Carrington J.C.,
Chen X., Dreyfuss G., Eddy S.R., Griffiths-Jones S.,
Marshall M., Matzke M., Ruvkun G., and Tuschl T., 2003,
A uniform system for microRNA annotation, RNA, 9(3):
277-279
http://dx.doi.org/10.1261/rna.2183803
PMid:12592000 PMCid:PMC1370393
Bari R., Datt Pant B., Stitt M., Scheible W.R., 2006, PHO2,