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宋云等：金花茶植物物种鉴定的
dCAPS
标记开发及其应用
1194
续表
1
Continuing table 1
凭证标本号
Voucher number
物种名
Species
采集地
Origin
GenBank
序列号
GenBank accession NO.
CAIQH08
金花茶
Camellia nitidissima
广西南宁
Nanning, Guangxi
KC878518
CAIQH09
华东山茶
-“
牡丹王
”
Camellia japonica var.
“kings
peony”
云南昆明
Kunming, Yunnan
KC878519
CAIQH10
华东山茶
-“
锦楼春
”
Camellia japonica
var.
“jinlouchun”
云南昆明
Kunming, Yunnan
KC878520
CAIQH11
云南山茶
-“
狮子头
”
Camellia reticulata. var.
“shizitou”
云南昆明
Kunming, Yunnan
KC878521
CAIQH12
云南山茶
-
小桂叶
Camellia reticulata.
var."xiaoguiye"
云南昆明
Kunming, Yunnan
KC878522
CAIQH13
云南山茶
-
牡丹茶
Camellia reticulata.
var."mudancha"
云南昆明
Kunming, Yunnan
KC878523
CAIQH14
云南山茶
-“
大玛瑙
”
Camellia reticulata.
var.
“damanao”
云南昆明
Kunming, Yunnan
KC878524
CAIQH15
云南山茶
-“
紫袍
”
Camellia reticulata. var.
“zipao”
云南昆明
Kunming, Yunnan
KC878525
CAIQH16
油茶
Camellia oleifera Abel.
云南昆明
Kunming, Yunnan
KC878526
CAIQH17
贵州连蕊茶
Camellia costei Levl.
云南昆明
Kunming, Yunnan
KC878527
根据文献中条码基因
psbA-trnH
(Kress and
Erickson, 2007)
、
rbcL
(Kress and Erickson, 2007)
、
trnL-F
(Taberlet et al., 1991)
、
GBSSI
(
杨俊波等
, 2006)
的引物及扩增条件
(
表
2)
进行扩增，
PCR
产物经
1.5%
琼脂糖凝胶电泳检测并在
紫外凝胶成像系统观察
合格后
,
由中国农科院测序中心测序。
3.2.2
序列比对及物种特异的
dCAPS
标记的开发
序列编辑和拼接应用
CodonCode Aligner V3.0
(CodonCode Co., USA)
，
17
个物种的
GBSSI
基因
序 列 提 交
GenBank
并 获 得 序 列 号
KC844915,
KC878512-KC878527 (
表
1)
。通过
DNAman software
进行序列比对寻找合适的
SNP
位点。
利用
dCAPS Finder 2.0 program (Neff et al., 2002)
和
Primer Premier 5.0
分别设计
dCAPS
引物及相应的
下游引物
(
表
3)
，由上海生物工程技术服务有限公司
合成。以
17
个山茶属物种基因组
DNA
为模板，
25 μL
PCR
反应体系中包括：
2.5 μL 10× EX
Taq
buffer
(Mg
2+
Plus)
，
2 μL dNTPs (2.5 mmol/L)
，上下游引物
(10 μmol/L)
各
1 μL
，
0.2 μL EX
Taq
DNA polymerase
(5 U/μL)
，
1μL
基因组
DNA (50 μg/μL)
。
PCR
扩增程
序：
94
℃
5 min
，
94
℃
30 s
，
55
℃
30 s
，
72
℃
50 s
，
35
个循环，
72
℃终延伸
10 min
，
4
℃保存
(
宋云等
,
2012)
。
PCR
扩增结束后，采用限制性内切酶
BstXI
酶切，酶切反应体系参照
Takara
内切酶说明书进行，
酶切产物经过
2.5% MetaPhor agarose
电泳检测，通
过紫外凝胶成像系统记录结果。