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分子植物育种(网络版)
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online)
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母本，T1C-19 为父本进行杂交，获得 cry1C 基因杂
合的 F1 代，F1 代自交获得 F2 代，在 F2 代中随机选
择 10 株进行 3 引物 PCR 检测，分别收获这 10 株自
交种子种植成 F3 代株系。
DNA 提取和 PCR 检测试剂均购自 Takara 公司。
3.2 方法
3.2.1 DNA 提取
取约 1~2 cm 长的水稻幼嫩叶片置于 2 mL 圆
底离心管中，加入 2×CTAB 400 μL 后在 QIAGEN
Tissuelyser 样品研磨仪中磨碎匀浆，置 60℃水浴
20 min，加入 400 μL 氯仿 /异戊醇(24:1) 震荡混匀
10 min，10 000 rpm 离心 10 min，取 200 μL 上清置
于另一加有 400 μL 95%预冷乙醇的 1.5 mL 离心管，
静置 10 min ，13 000 r/min 离心 10 min，弃上清后
晾干，加入 50 μL 灭菌的超纯水溶解。
3.2.2 水稻内参基因的 PCR 检测
为了保证水稻基因组 DNA 的质量和 PCR 检测
体系的正常可靠，以水稻 actin 基因作为参照基因
(Liu et al., 2007)。actin 基因(RAc1, Accession number
X16280)上下游引物分别为 5'-aagatcctgacggagcgtg-
gttac-3'和 5'-cttcctaatatccacgtcgcacttc-3'。 PCR 产物
大小为 303 bp。 PCR 反应体系为 15 μL，其中包含
10×PCR 缓冲液( 含 Mg2+ ) 1.5 μL，2.5 mmol/L dNTP
1.2 μL，10 µmol/L 上下游引物各 0.3 μL，5 U/μL Taq
DNA 聚合酶 0.2 μL，DNA 模板 1 μL。PCR 反应程
序为 94℃反应 4 min，然后进入三温度循环，每个
循环包括 94℃反应 40 s，58℃反应 30 s，72℃反应
30 s，共 30 个循环，最后 72℃反应 5 min。
3.2.3 三引物设计
在 T1C-19 中 T-DNA 序列左侧水稻基因组序列
(GenBank: HQ161062.1)中设计一条正向引物 C1，
序列为 5'-cacgaaagagaagggcactc-3'；在 T-DNA 序列
右侧水稻基因组序列中设计一条反向引物 C3 ，序列
为 5'-gcaactgtgttgtaggtatg- 3'；在 T-DNA 中靠近左侧
水稻基因组处设计一条反向引物 C2 ，序列为 5'-
tcccagataagggaattaggg-3'。 T-DNA 的插入位点和引
物位置( 图 6a)，T-DNA 的侧翼序列(图 6b)。在非转
基因水稻中，C1+C3 扩增出一条 386 bp 的 PCR 产
物；在转基因纯合体中 C1+C2 扩增出一条 512 bp
的 PCR 产物，由于 T-DNA 序列过长，C1+C3 没有
扩增产物。在转基因杂合体中同时扩增出 386 bp 和
512 bp 的 2 条带。引物利用 Premier 3 软件设计，由
上海生工生物工程技术有限公司合成。
图 6 三引物在转基因水稻 T1C-19 基因组中的位置
注: a: 三引物 C1、C2 和 C3 在水稻基因组和 T-DNA 中的位
置示意图, C1 在 T-DNA 插入位点的左侧水稻基因组序列中,
为正向引物, C3 在 T-DNA 插入位点的右侧水稻基因组序列
中, 为反向引物, C2 在 T-DNA 中靠近左侧部分; b: T-DNA 部
分序列及插入位点两端的序列; 中间大写部分为 T-DNA 序
列, 左右两侧小写部分为插入位点两端水稻基因组序列, 箭
头所示为三引物 C1、C2 和 C3 所在序列位置
Figure 6 The position of three primers in the genome of T1C-19
Note: a: The position of primer C1, C2 and C3 in rice genome
and T-DNA sequence, C1 is a forward primer in the left flanking
rice genomic sequence of T-DNA in T1C-19, C3 is a revert
primer in the right flanking rice genomic sequence of T-DNA in
T1C-19, C2 is a revert primer in the left part of T-DNA sequence;
b: The partial sequence of T-DNA and the flanking rice genomic
sequences of T-DNA; The middle uppercase part is the T-DNA
sequence, the left and right lowercase part are the flanking rice
genomic sequences of T-DNA , the arrows indicate the positions
of primer C1, C2 and C3