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分子植物育种
(
网络版
)
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online)
1109
C2+0.4 μL 10 μmol/L C3
，体系
2
：
0.5 μL 10 μmol/L
C1+0.4 μL 10 μmol/L C2+0.3 μL 10 μmol/L C3
，体系
3
：
0.5 μL 10 μmol/L C1+0.4 μL 10 μmol/L C2+0.2 μL
10 μmol/L C3
，体系
4
：
0.5 μL 10 μmol/L C1+0.4 μL
10 μmol/L C2+0.1 μL 10 μmol/L C3
。并利用转基因
纯系
T1C-19
、转基因杂合体
9311/T1C-19
和非转基
因材料
9311
基因组
DNA
为模板，进行三引物
PCR
扩增。由图
4
看出，
4
个
PCR
反应体系均能区分转
基因杂合体、转基因纯合体和非转基因材料，
T1C-19
、
9311
及杂合体
9311/T1C-19
中扩增出清晰
的片段，片段大小分别与
T1C-19
和
9311
中的片段
大小一致。体系
3
的扩增效果最好，表现在杂合体
两条片段的扩增量几乎一致。
图
4
三引物多重
PCR
反应体系中不同引物使用量的扩增效果
注
: M: DL2000 marker; 1~3: T1C-19, 9311/T1C-19, 9311;
A:
体系
1, 0.5 μL 10 μmol/L C1+0.4 μL 10 μmol/LC2+0.4 μL
10 μmol/LC3; B:
体系
2, 0.5 μL 10 μmol/LC1+0.4 μL 10 μmol/L
C2+0.3 μL 10 μmol/L
C3; C:
体系
3, 0.5 μL 10 μmol/L
C1+0.4 μL 10 μmol/L C2+0.2 μL 10 μmol/L C3; D:
体系
4,
0.5 μL 10 μmol/LC1+0.4 μL 10 μmol/LC2+0.1 μL 10 μmol/LC3
Figure 4 The effects of primer quantities on tri-primer multiplex
PCR amplification
Note: M: DL2000 marker, 1~3: T1C-19, 9311/T1C-19, 9311; A:
System 1, 0.5 μL 10 μmol/L C1+0.4 μL 10 μmol/L C2+0.4 μL
10 μmol/LC3; B: System 2, 0.5 μL 10 μmol/LC1+0.4 μL 10 μmol/L
C2+0.3 μL 10 μmol/L C3; C: System 3, 0.5 μL 10 μmol/L
C1+0.4 μL 10 μmol/L C2+0.2 μL 10 μmol/L C3; D: System 4,
0.5 μL 10 μmol/LC1+0.4 μL 10 μmol/LC2+0.1 μL 10 μmol/LC3
1.5
三引物多重
PCR
扩增体系在转基因后代材料中
的验证
利用优化后的三引物多重
PCR
扩增体系
3
对
T1C-19
，非转基因水稻
R838
、宜恢
72
及其杂种
R838/ T1C-19
和宜恢
72/T1C-19
进行检测，结果见
图
5
。在
T1C-19
中扩增出一条
512 bp
的片段，在
R838
、宜恢
72
中分别扩增出一条
386 bp
片段，在
R838/T1C-19
和宜恢
72/T1C-19
中同时扩增出
512 bp
和
386 bp
的两条片段。检测结果表明，在这些材料
中该体系同样可以准确地区分转基因杂合体、转基
因纯合体和非转基因材料。
在
9311/T1C-19
、
R838/T1C-19
和宜恢
72/T1C-19
的
F
2
代植株中分别随机取
10
株，利用
PCR
扩增
体系
3
进行检测，检测结果显示，在
F
2
代中出现
了转基因杂合、转基因纯合和转基因阴性单株的
分离
(
表
1)
。收获这
10
株的种子种植成
F
3
代株系，
每个株系取
20
株进行三引物
PCR
检测。检测结果
表明，来自
F
2
代转基因纯合和转基因阴性单株的
F
3
家系目标基因稳定，仍为转基因纯合和转基因阴
性基因型，而来自
F
2
代转基因杂合单株的
F
3
家系
中目标基因发生分离，出现转基因杂合、转基因纯
合和转基因阴性单株。以上结果表明，利用该三引
物多重
PCR
扩增体系可以准确地鉴定出
T1C-19
及
其衍生的后代材料中转基因杂合、转基因纯合和转
基因阴性植株。
图
5
三引物多重
PCR
扩增体系在不同水稻材料中的验证
注
: M: DL2000 marker; 1: T1C-19; 2: R838; 3:
宜恢
72; 4:
R838/ T1C-19; 5:
宜恢
72/ T1C-19
Figure 5 The tri-primer multiplex PCR amplification in various
rice varieties (combinations)
Note: M: DL2000 marker; 1: T1C-19; 2: R838; 3: Yihui72; 4:
R838/ T1C-19; 5: Yihui72/ T1C-19
2
讨论
目前，将
Bt
基因导入到水稻中并获得良好抗
性的水稻品种越来越多
(Chen et al., 2005; Ye et al.,
2001b)
，导入
cry1C
基因的
T1C-19
是抗螟虫表现
最好的转基因材料之一
(Tang et al., 2006)
，随着抗虫
转基因技术的广泛应用和日趋成熟，利用
T1C-19
作为抗虫基因供体，已经培育了多个抗虫水稻新品
系
(
田雨等
, 2011;
冯睿彤等
, 2012)
。目前对
T1C-19
的杂交后代
cry1C
基因检测的分子标记均属于显性
标记
(Tang et al., 2006; Yang et al., 2011;
田雨等
,
2011;
李孝琼等
, 2012)
，这些标记只能判断外源基因
的有无，但无法区别基因型是纯合还是杂合。本研
究建立了用于检测转基因水稻
T1C-19
及其衍生材
料中外源基因的三引物多重
PCR
检测体系，该体系
可以准确简便地区分出转基因杂合、转基因纯合和
转基因阴性三种基因型。