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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1376
-
1382
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1376
-
1382
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1377
植物中泛素化研究最为深入透彻的是模式植
物拟南芥，大约有
1 400
个基因
(
大约占总蛋白质数
量的
5%)
编码泛素化过程的
3
大类酶。这其中，编
码
E1
的基因有
2
个，发生突变时拟南芥死亡；
E2
基因有
37
个，
E2
-
like
基因有
8
个；
E3
基因则有
1 300
个，泛素化底物的特异性是由
E3
决定的
(Smalle and
Vierstra, 2004)
。
近年来，
E3
蛋白的作用研究开展较多并取得了
较大进展
(
许传俊和李玲
, 2007; Göhre et al., 2008;
Lai et al., 2009; Lee et al., 2009; Pan et al., 2009)
，而
E2
蛋白功能研究尽管也取得了一定进展，但相对缓
慢
(
王金利等
, 2010)
。
油茶
(
Camellia oleifera
)
与油橄榄、油棕、椰子
并称为世界四大木本油料树种，是我国的本土树种，
现有面积达
3.3×10
6
hm
2
，是我国亚热带地区山区林
农的重要经济来源之一，在江西、湖南、浙江、广西、
福建等省的经济林产业中占有十分重要的地位
(
庄
瑞林
, 2008)
。近年来，在国家政策扶持下，各省均
有相关政策和资金支持，油茶产业发展迅速，与之
相呼应，油茶良种选育、丰产栽培技术等研究进展
较快，新品种丰产林面积不断扩大，经济效益显著
提升。但与农作物、杨树、杉木等其它研究开展较
早的林木相比，油茶分子基础研究甚少。郭静怡等
已克隆了一个油茶泛素连接酶
E2
基因
(
编码
152
个
氨基酸残基，本论文中命名为
UBE2A)
，并对其进
行了
cDNA
序列分析和
RNAi
表达载体构建
(
郭静怡
,
2011)
，但对其编码的蛋白质的性质特点等未作研究。
本研究采用
solexa
技术对普通油茶“长林
4
号”
无性系发育中的种子转录组测序，获得了
1
条编码
泛素结合酶
(E2)
的全长
cDNA
序列，命名为
UBE2S
，
通过对该基因的序列分析和编码蛋白质的结构预
测分析，对普通油茶发育中种子的蛋白泛素化过程
初探端倪，以期为进一步的深入研究奠定基础。
1
结果分析
1.1
泛素结合酶
(UBE2S)
的全长
cDNA
序列分析
通过序列比对和分析，
UBE2S
基因
cDNA
全长
1 155 bp
，编码区自
183
位的起始密码子
ATG
起，终
止于
995
位的
TGA
，
5' UTR 182 bp
，
3' UTR 160 bp
，
编码
270
个氨基酸，推测蛋白质分子量是
29.36 KD
。
编码的
270
个氨基酸中有
33
个强碱性
AA (K, R)
，
30
个强酸性
AA (D, E)
，
88
个疏水性
AA (A, I, L, F, W, V)
和
72
个极性
AA (N, C, Q, S, T, Y)
。其
AA
序列为：
MATNENLPPNVIKQLAKELKNLDETPPEGIKVG
VNDDDFSIIYADIEGPAGTPYENGVFRMKLILSHD
FPHSPPKGYFLTKIFHPNIATNGEICVNTLKKDWN
PSLGLRHVLIVVRCLLIEPFPESALNEQAGKMLLE
NYEEYARHARLYTGIHALKQKPKFKSGAISESTTA
LNVDQSNTSVLNVDEKKASSGAALPLPSPLAST
TTFTKGGNGQDQPASALNSTTETGVSSDSVAAPP
PVTQKKEVTLAKVQADKKKMDARKKSLKRL
1.2 UBE2S
基因同源性比对分析
通过
Blast
比对，筛选出序列同源性较高的
2
个物种的
UBE2S
序列，分别为大豆和葡萄，油茶
UBE2S
基因的
cDNA
序列与上述
2
个物种的同源性
分别为
64.19%
和
68.63%
。采用
clustalX
软件对上述
3
个物种
E2
的氨基酸序列进行多序列比对分析显示
(
图
1)
，
3
个物种
UBE2S
氨基酸序列同源性达
84.69%
，
油茶的
UBE2S
和其余
2
个物种的
UBE2S
的氨基酸序
列同源性分别为
78.76%
和
81.47%
，说明
UBE2S
的氨
基酸序列在植物中具有较高的保守性。
1.3
编码蛋白的保守区域分析
ScanProsite
和
CDD
对油茶
UBE2S
保守结构域
的分析结果显示，
UBE2S
第
13~145
位氨基酸碱基
为其泛素结合酶基因家族的保守区域，第
79~127
位氨基酸残基区域中有
21
个残基与泛素形成硫酯
键中间产物
(
图
3C)
，其中
94
位的半胱氨酸残基是
活性位点
(
图
2)
。该活性位点旁边有如下保守序列
[FYWLSP]-H-[PC]-[NHL]-[LIV]-x(3,4)-G-x-[LIVP
]-C-[LIV]-x(1,2)-[LIVR]
。第
13
的
K
、
70
的
P
、
71
的
H
、
101
位的
P
、
102
位的
S
共
5
个残基是与
E3
酶相
互作用的位点
(
图
3D)
。
1.4
三维结构分析
UBE2S
三维结构显示，该基因仅包含一个保守
功能结构域，该结构域由
4
个
α
螺旋和
4
个
β
折叠
片构成，
α1
、
α2
和
α3
分别位于保守结构域的两侧，
位于
α4
与
β
折叠片之间的长环上的半胱氨酸活性
位点，处于蛋白质表层的浅窝中
(
图
4
粉色圆球所示
位置
)
。此外，与泛素通过硫酯键结合的残基位点及
与
E3
相互作用的残基位点也位于蛋白质浅表凹陷
处周围
(
图
5
和图
6)