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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1354
-
1359
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1354
-
1359
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1358
EST-SSR
引物
(
表
4)
。设计引物时主要有以下要求：
EST
序列长度大于
100 bp
；
SSR
序列的开始和结
束位置分别距
5’
和
3’
端不少于
20 bp
；引物长度
18~24 bp
；退火温度
Tm
值介于
40.4~65.4
℃，且上
下游引物复性温度相差不大于
5
℃；
GC
含量为
40%~60%
；预期扩增产物
100~500 bp
；尽量避免
引物二聚体、错配和发夹及颈环结构等
(
安泽伟
等
, 2009)
。
表
4 7
对菠菜
EST-SSR
序列引物
Table 4 7 EST-SSR primers designed from spinach EST sequences
引物编号
Primer code
SSH
基元
SSH motif
来源
EST
编号
ESTcode
Tm
(
℃
)
GC
(%
)
序列
(F:5′-3; R: 3′-5′)
Sequences (F: 5′-3; R: 3′-5′)
P01
(CAC)6
HS097056
60.00
38.89
50.00
F: AACTCTCACGCATTCACA
R: GTGGTGGTGGTGTTATGA
P02
(GGTTTT)4
HS097067
60.00
47.37
42.11
F: ATTCACTCTACGACGATGG
R: AGGACGAAGTTCAACAAGA
P03
(CAG)5
HS097148
60.00
40.00
50.00
F: AGTTCGTGTTCATCATAGGT
R: CAGCAGGAGGAATGTTGT
P04
(GCA)5
HS097173
60.00
42.11
42.11
F: AGCAGCAGCATAACATCAA
R: AATCTTGGTTGGCTTCACA
P05
(TGT)5
HS097184
60.00
40.00
47.37
F: AGAAGTTCCTGTGTTGTTGT
R: CAAACCCTAGTGCCGTAAT
P06
(AAGAT)5
HS097198
60.00
40.91
55.56
F: AGAGAAGAGAAGAGAAGAGAAG
R: TGGAGGTTGTTGGATGGA
P07
(TAT)6
HS097215
60.00
50.00
40.00
F: CCTTGGTTGGATGGTGTA
R: CACAGACATACTGTAGTTGA
3.5 PCR
扩增和琼脂糖凝胶电泳
设置
25 µL
的
PCR
反应体系：
1×
Taq
DNA
聚合酶
缓冲液、
2.5 mmol/L MgCl
2
、
0.5 U DNA Polymerase
、
200 µmol/L dNTP
、上下游引物各
0.25 µmol
、模板
DNA 100 ng
。所用试剂购自宝生物工程
(
大连
)
有限
公司。温度循环条件：
95
℃预变性
5 min
；循环步骤
为
94
℃
1 min
、
60
℃
1 min
、
72
℃
2 min
共
45
个循环；
最后
72
℃延伸
10 min
。
琼脂糖凝胶电泳：扩增后的产物与
6×loading
buffer
混合，经过
3.0%
的琼脂糖凝胶
(TBE
缓冲液
,
含
EB 0.5 µg/ml, 100 V
电压
)
电泳分离，检测扩增产
物的可用性和多态性。用
Gel Doc EZ
成像系统进行
观察、拍照和分析。
作者贡献
第一兼通讯作者邓传良确立了本论文的总体思路，对
研究过程中存在的问题进行指导并进行论文的修改；第二
作者高俊和第三作者曹莹共同完成了本文研究中的实际
工作，并进行了本论文的起草；其它作者秦瑞云、高武军
和卢龙斗在实验过程中给予了很多帮助和指导，并对论文
的修改提出了一些建议
。
致谢
本论文得到国家自然科学基金项目
(
编号：
31000165)
，
河南师范大学校青年骨干教师项目资助，在此表示
参考文献
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