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王海莲等
, 2011,
高粱
SSR
技术体系的优化及分子连锁图谱的构建
,
分子植物育种
Vol.9 No.47 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0047)
1356
2
讨论
随着我国能源形势的日趋严峻，甜高粱作为一
种能源作物受到越来越多的关注；同时由于高粱具
有较小的基因组和已经完成的全基因组测序，对其
分子遗传学和分子生物学方面的研究也越来越多。
在高粱分子连锁图谱构建，品种间多态性鉴定以及
基因定位中，一般需要对几百对甚至几千对
SSR
引
物进行鉴定，这不仅需要大量的资金，而且还需要
大量的时间。因此，在最短的时间内用最经济的方
法达到满意的实验结果，是提高实验效率的关键。
SSR
技术由一系列的步骤组成，包括
PCR
体系的配
制；
PCR
扩增；凝胶的配制，电泳，染色等，其中
任何一个步骤的失败都将导致最终实验结果的失
败，而提高每一个步骤的实验效率都将提高整个实
验的效率。本实验从
PCR
体系的大小，非变性聚丙
烯酰胺凝胶的浓度和染色方法进行了研究。实验结
果表明对于多态性好的引物，采用
10 µL PCR
反应
体系，
6%
的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，采用
快速银染法进行染色可以得到理想的目的条带。
在一般的
SSR
实验中，
PCR
体系一般采用
20 µL
或更大的反应体系。从本实验的研究结果看，
10 µL
PCR
反应体系已经基本满足实验的要求。相对与一
般的
15 µL
，
20 µL
或更大的反应体系，既节约了三
分之一以上的实验成本，又满足了实验要求。在实
际操作过程中，由于不同的引物片段大小不同，扩
增效率不同，适当的调整点样量，可满足实验的需
求。分离分子的大小取决于丙烯酰胺的浓度。使用
低浓度凝胶分离较大的分子，高浓度的凝胶分离较
小的分子。
SSR
扩增产物一般在
100 bp~400 bp
之间，
使用
6%
的非变性聚丙烯酰胺凝胶，不仅节约时间和
药品，而且完全可以将
SSR
扩增产物分离开来。在
电泳时本实验采用了常规的非变性聚丙烯酰胺凝
胶染色方法和快速银染方法。快速银染方法将常规
的染色方法中的固定和渗透两个步骤合为一个步
骤，省略了硫代硫酸钠洗胶步骤，节省了大约一半
的时间，仍得到了较为满意的实验效果。当然，上
述快速高效的
SSR
技术只是针对筛选好的多态性引
物。对于扩增片段过大或过小，或者特异性不高的
引物，还需要摸索最佳的实验条件，以达到预期的
实验目的。
本研究构建的遗传图谱上共包含
118
个标记位
点，其中包括高粱的
116
个高粱
SSR
标记和
2
个甘
蔗的
SSR
标记，覆盖高粱基因组的
1884.6 cM
，标
记间平均距离为
15.97 cM
，共
15
个连锁群
(
图
3)
。
与
Wu
等
(2006)
研究结果相似，该研究完全利用
SSR
标记，构建的连锁图谱含有
16
个连锁群。该分子
连锁图谱基本满足对高粱重要农艺性状进行
QTL
初步定位的需要。对于主效
QTL
的精细定位以及
图位克隆，还需要利用新的
SSR
标记，进一步增加
染色体上的标记密度，构建完全饱和的分子连锁图
谱，以期为能源甜高粱的分子遗传改良提供一定的
理论指导。
3
材料与方法
3.1
试验材料
所用样品为普通高粱品种石红
137
和甜高粱品
种
L-
甜，以及杂交得的
F
2
群体。
3.2
试验方法
3.2.1 DNA
的提取
高粱叶片总
DNA
提取参照
Dellaporta
等
(1983)
的方法，稍做修改。提取的总
DNA
样品溶于
TE
缓冲液，并用
MBA 2000 µV/VS
光谱仪
(Perkin
Elmer
有限公司
)
进行浓度测定和品质检测。用双蒸
水把
DNA
样品稀释成
20 ng/µL
的工作液，储存在
4
℃冰箱中，作为分析时的模板。
3.2.2 PCR
反应
所用高粱引物由上海生工生物工程技术服务
有限公司合成。
PCR
反应采用
10 µL
，
15 µL
，
20 µL
和
25 µL 4
种反应体系。反应体系各样品依次加好
后，加
1
滴石蜡油，防止蒸发。使用
PTC-200
热循
环仪
(MJ Research Inc.)
进行扩增。按如下程序扩
增：
94
℃预变性
5 min
后，
94
℃变性
30s
、
55
℃退
火
30s
、
72
℃延伸
1 min
循环扩增
35
次，最后于
72
℃
延伸
7 min
。
3.2.3 PCR
产物的检测
采用
10%
，
8%
和
6%
三种浓度的非变性聚丙烯
酰胺凝胶对扩增产物进行分离；采用两种染色方
法，一种是常规的非变性聚丙烯酰胺凝胶染色方法
(Sanguinetti et al., 1994)
，另一种是快速银染方法
(Carlos et a1., 1994)
。本实验对两种方法略作了改
动，均省略了用终止液终止反应，显影后直接用蒸