Basic HTML Version
张如华等
, 2011,
柽柳
EST-SSRs
标记开发与群体检测
,
分子植物育种
Vol.9 No.38 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0038)
1295
2.2 EST-SSR
标记的多态性、通用性及应用
Brown
等
(2001)
利用火炬松的
90
个
EST
开发的
标记，对松属单维管束亚属与双维管束亚属和松科
的花旗松进行了比较作图研究，结果表明
89%
、
49%
和
22%
的
EST
引物可以从双维管束亚属、单维管束
亚属及花旗松中实现扩增。通过
75
对引物对来自柽
柳的
5
个天然群体进行的检测，其中的
40
对可以扩
增出产物，占
53%
，
14
对引物在检测的群体中表现
出较好的多态，说明
SSR
标记的通用性在柽柳属植
物中与其它植物中相似。群体检测的结果表明，
Nei
基因多样性指数都在
0.5
以上，根据遗传距离能很好
地区分不同群体，聚类结果与柽柳群体的空间分布
较为一致
(
表
4,
图
2)
。随着更多柽柳群体
EST-SSR
标
记检测结果的获得，将对柽柳遗传多样性及群体遗
传结构有更加全面的认识。相对于
RAPD
等显性标
记
(
赵景奎等
, 2008)
，开发的
SSR
标记能获得更为丰
富的群体内、群体间遗传变异信息，即能检测出群
体内更多的遗传多样性，同时更容易区分群体间的
差异性，故可作为进行群体遗传学研究的理想工具
之一。由于通过
EST
序列开发
SSR
标记是最经济、
快速和有效的方法之一，对那些研究基础比较薄弱
的物种，通过利用其它研究基础较好物种
(
一般认为
同属及近缘属中
)
的
EST
序列，开发种属之间的通用
EST-SSR
标记是可行的。本研究开发的引物也可直
接应用于柽柳遗传学其它方面的研究。随着柽柳属
植物研究的深入，相信将有更多的
EST-SSR
标记可
开发利用。
3
材料和方法
3.1
材料与试剂
试验材料采自山东河口、垦利，浙江余姚、海
盐、慈溪的
5
个柽柳天然群体。群体内取样个体之
间的空间距离在
50
米以上，每个群体采集
50
株左右
生长良好个体的穗条，穗条扦插繁殖成无性系保存
在苗圃内
,
视样品
DNA
提取质量的好坏，最终确定群
体检测用各群体个体数量见表
5
。
表
5
柽柳采集地情况
Table 5 The geographical information of 5 natural colonies of
T. chinensis
L.
群体名称及编号
Pop ID
经度
/
纬度
Latitude /Longtitude
林分状况
Stand Status
取样个体数
Samples
浙江慈溪
(CIXI.Z)
Zhejiangcixi (CIXI.Z)
121°45'/30°11'/
天然林
Natural forest
51
浙江海盐
(HAIYAN.Z)
Zhejianghaiyan (HAIYAN.Z)
120°50'/30°25'/
天然林
Natural forest
40
浙江余姚
(YUYAO.Z)
Zhejiangyuyao (YUYAO.Z)
121°6'/29°8'/
天然林
Natural forest
43
山东东营河口
(HEKOU.S)
Shandongdongyinghekou (HEKOU.S)
118°50'/38°07'/
天然林
Natural forest
30
山东东营垦利
(KENLI.S)
Shandongdongyingkenli (KENLI.S)
119°02'/37°48'/
天然林
Natural forest
38
试验所用
Taq
酶、
dNTPs
、
Marker
等试剂均购自
天根
(Tiangen)
生化科技公司，设计的引物由上海英
骏
(Invitrogen)
生物技术有限公司合成。
PCR
所用仪
器为
PE9600 (ABI
公司
)
，
PCR
产物电泳在
DYCZ
-
32
型电泳槽
(
北京六一仪器厂
)
中电泳分离。
3.2
方法
3.2.1 DNA
提取
采用改良的
CTAB
硅珠吸附法
(Doyle and Doyle,
1990)
以柽柳叶提取基因组总
DNA
。
3.2.2 EST
重复序列的获得
从
NCBI
数 据 库
(http//:www.ncbi.nlm.nil.gov/
sites/entrez)
收集柽柳属植物
EST
序列，对
EST
序列采
用
vecscreen
在线工具
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
VecScreen/VecScreen.html)
去除载体序列后，经
Phrap
软件拼接，得到无冗余独立基因
(Unigene)
序
列，对所得的独立基因序列采用
SSRIT (simple
sequence repeat identification tool)
在线工具
(http://
acorn.cshl.org/db/searches/ssrtool)
进行
SSR
检索。要
求
SSR
长度不少于
18~22
核苷酸，如二核苷酸重复不
少于
9
次，四核苷酸重复不少于
5
次，六核苷酸重复