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李健等, 2011, 金花茶 SRAP-PCR 反应体系的优化与确立, 分子植物育种 Vol.9 No.23 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0023)
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图 2 金花茶基因组 DNA 的 SRAP-PCR 扩增图谱
注: M: 100 bp Plus DNA Ladder; 1- 10: 10 个金花茶单株编号
Figure 2 SRAP-PCR amplification pattern of genomic DNA
from Camellia nitidissima
Note: M: 100 bp Plus DNA Ladder; 1-10: No of 10 individuals
of Camellia nitidissima
SRAP-PCR 反应条件进行优化是非常必要的。正交
实验设计可以考察各因素之间的相互效应，具有均
衡分散、综合可比、伸缩灵活及效应明确的特点，
能迅速获得满意的试验结果，而且试验规模小，节
省人力物力。所以利用正交实验设计对影响
SRAP-PCR 反应的主要因素进行筛选，能较快地寻
找到合适的反应参数,避免单因素实验结果的不足。
但在个别因素用量方面也存在一定差别，可能由于
正交设计中主要根据电泳条带的清晰度及条带数
目判断依据带有一定的主观成分所致 (邹小云 ,
2010)。
袁菊红等(2007)的研究结果表明，Mg2+浓度对石
蒜 SRAP 扩增结果的影响最明显，但 dNTPs 浓度对
扩增结果影响不明显；本研究结果和郭大龙等(2006)
的研究结果一致，而与张飞等(2009)和王艳青(2009)
的研究结果存在差异，这可能与研究物种的不同有
一定的关系。在不同物种的 SRAP-PCR 反应体系
中，既有相似的影响因素，也有各自特殊的反应条
件，因此，应针对不同的研究对象设计不同的
SRAP-PCR 反应体系。本研究从经济有效的角度,
在对扩增图谱进行直观分析和对条带数目进行统
计分析的基础上，对最优反应体系参数做了适当
的调整，确定了金花茶基因组 DNA 的 SRAP-PCR
的最佳反应体系为：反应体系总体积 20 μL,含
1.50 mmol/L Mg2+、0.20 μmol/L dNTPs、0.30 μmol/L
引物、75 ng 模板 DNA、1.00 U Taq DNA 聚合酶及
1×PCR Buffer。
对该体系的验证结果证明, 本研究建立的金花
茶 SRAP-PCR 反应体系稳定、可靠, 这一优化的反
应体系为进一步利用 SRAP 分子标记技术对金花茶
的资源鉴定、分类和分子遗传图谱的构建及基因定
位奠定了良好的试验基础。
3 材料与方法
3.1 供试材料与试剂
供试材料为金花茶，2010 年采自上海植物园山
茶资源圃。
用于 SRAP 反应的引物等试剂均购自上海生
工生物工程技术服务有限公司，经初步筛选，确
定 Me2 (TGAGTCCAAACCGGAGC)和 Em10 (GA
CTGCTACGAATTCAG) 作为此次正交试验的固
定引物。
3.2 金花茶基因组 DNA 模板的提取与检测
取金花茶嫩叶采用 CTAB 微量法提取基因 DNA，
将基因组 DNA 和 Lambda DNA 用质量体积分数 1.0%
琼脂糖凝胶电泳，以检测基因组 DNA 的纯度和浓
度,并用双蒸水稀释至 100 ng/μL，-20℃保存备用。
3.3 SRAP-PCR 反应体系的正交实验设计
以金花茶的嫩叶为材料，采用正交设计 L16(45)
进行试验，PCR 反应各因素水平见表 2。对 Mg2+
浓度、 dNTPs 浓度、Taq DNA 酶用量、引物浓度
和模板 DNA 用量进行 5 因素 4 水平正交实验，3
次重复。
3.4 SRAP-PCR 扩增及检测
扩增程序：94℃预变性 5 min；94℃变性 40s，
37℃复性 50 s，72℃延伸 1.5 min, 8 个循环反应；
94℃变性 40 s，50℃复性 50 s ，72℃延伸 1.5 min，
32 个循环反应；72℃延伸 10 min。扩增反应结束后，
分别加入 0.5 μL 6×溴酚蓝，离心混匀后,取 7 μL 扩
增产物用质量体积分数 2.0%的琼脂糖凝胶电泳 ,凝
胶中含 0.05% 的溴化乙锭 (EB) 。电极缓冲液为
1×TAE，电泳电压 5V/cm，电泳时间 45 min，电泳
结束后,在凝胶成像分析仪上观测并拍照。
3.5 SRAP-PCR 反应体系稳定性的检测
随机选取金花茶 10 个个体植株的基因组 DNA 作
为模板，选用引物组合 Me5-Em3，按照上述 SRAP-
PCR 扩增及检测方法,对优化确定的金花茶基因组
DNA 的 SRAP-PCR 反应体系的稳定性进行检测。