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李健等
, 2011,
金花茶
SRAP-PCR
反应体系的优化与确立
,
分子植物育种
Vol.9 No.23 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0023)
1168
唐绍清等
, 1998), ISSR (
宾晓芸等
, 2005)
和
AFLP (
宾
晓芸
, 2005)
。
相关序列扩增多态性
(sequence-related amplified
polymorphism, SRAP)
分子标记是一种基于
PCR
的
新型标记
,
具有简便、快捷、稳定、高效、共显性高
及在基因组中分布均匀等特点
(Li et al., 2001)
。该分
子标记的引物设计简单，上、下游引物分别对外显
子区域及内含子和启动子区域进行特异扩增，根据
不同个体和物种的内含子、启动子及间隔区长度的
不同而产生多态性，并且
17 bp
的正向引物、
18 bp
的反向引物以及
50
℃的退火温度保证了扩增结果
的稳定性。迄今为止，
SRAP
标记在观赏植物研究
中的应用甚少，仅在石斛
(
樊洪泓等
, 2006)
、石蒜
(
袁
菊红等
, 2007)
、百合
(
陈琼等
, 2007)
、牡丹
(Han et al.,
2008; Hao et al., 2008)
、桂花
(
李梅等
, 2009)
和菊花
(
张飞等
, 2009; Zhang et al., 2010)
中有相关报道，在
金花茶研究中尚未见报道。
由于不同的植物的
SRAP
最佳反应体系差别很
大
(
刘立军等
, 2006)
，甚至同一种植物在不同的试验
条件下其研究结果都有差异
(
柴丹丹等
, 2008)
。因
此，本研究以观赏植物金花茶基因组
DNA
为模板
,
探讨
SRAP-PCR
反应体系中
5
种因素对扩增的影
响，以期获得金花茶
SRAP
扩增的最佳反应体系，
为进一步利用
SRAP
标记技术开展金花茶种质资源
遗传多样性研究、连锁遗传图谱构建和分子标记育
种等方面将发挥重要作用。
1
结果与分析
1.1
金花茶茶基因组
DNA
的
SRAP-PCR
反应体系
的正交实验
参照穆立蔷等
(2006)
的方法，对金花茶基因组
DNA
的
SRAP-PCR
反应体系中
Mg
2+
浓度、
dNTPs
浓度、
Taq
DNA
聚合酶用量、引物浓度和模板
DNA
用量等
5
个因素
4
个水平组合的正交实验结果进行
统计分析，结果见表
1
。由表
1
中的
R
值可以看出，
对金花茶基因组
DNA
的
SRAP-PCR
扩增反应结果
的影响由大到小依次为
: Mg
2+
浓度、模板
DNA
用
量、
Taq
DNA
聚合酶用量、引物浓度、
dNTPs
浓度。
从
k
值来看，
Mg
2+
浓度为
1.50 mmol/L
、
dNTPs
浓
度为
0.25 μmol/L
、引物浓度为
0.30 μmol/L
、
Taq
DNA
聚合酶用量为
1.0 U
、模板
DNA
用量以
100 ng
时，扩增结果最好。
根据正交实验结果，初步确立金花茶基因组
DNA
的
SRAP-PCR
反应的适宜反应体系应含
1.50 mmol/L
Mg
2+
、
0.25 μmol/L dNTPs
、
0.30 μmol/L
引物、
100 ng
模板
DNA
及
1. 00 U
Taq
DNA
聚合酶。
采用不同的反应体系，金花茶基因组
DNA
的
SRAP-PCR
扩增电泳图谱见图
1
。由图
1
可以看出，
采用
dNTPs
浓度、
Mg
2+
浓度、引物浓度、
Taq
DNA
聚合酶用量以及模板
DNA
用量不同的
16
个反应体
系，扩增结果存在差异。第
5
、
6
、
7
、
8
、
9
、
10
、
11
、
13
和
14
号反应体系的扩增效果较差
,
条带弱而
且多态性较低，有弥散和拖尾现象；第
1
、
2
、
4
、
12
和
15
号反应体系的扩增条带虽然丰富，但是条
带较弱
;
第
3
和
16
号反应体系的扩增结果不仅多态
性好，且条带较清晰。综合比较条带强弱及多态性
,
初步选定将第
3
号反应体系
(
含
1.50 mmol/L Mg
2+
、
0.20 μmol/L dNTPs
、
0.40 μmol/L
引物、
75 ng
模
板
DNA
及
1.50 U
Taq
DNA
聚合酶
)
作为金花茶基因
组
DNA
的
SRAP-PCR
反应体系。
1.2
金花茶
SRAP-PCR
反应体系的确立
对表
1
的统计分析结果及图
1
的直观分析结果
进行综合分析，结果显示，根据正交实验结果筛选
出的金花茶基因组
DNA
的
SRAP-PCR
适宜反应体
系与根据扩增图谱筛选出的第
3
号反应体系存在
差异。综合考虑实验成本及扩增效果，最终确定金
花茶基因组
DNA
的
SRAP-PCR
的最佳反应体系
为：反应体系总体积
20 μL
，含
1.50 mmol/L Mg
2+
、
0.20 μmol/L dNTPs
、
0.30 μmol/L
引物、
75 ng
模板
DNA
、
1.00 U
Taq
DNA
聚合酶及
1×PCR Buffer
。
1.3
金花茶
SRAP-PCR
反应体系的稳定性分析
应用上述最佳反应体系，随机选择
SRAP
引物
组合
Me5
-
Em3
，对随机选择的金花茶
10
个单株进
行
SRAP-PCR
扩增，结果见图
2
。由图
2
可以看出，
引物组合对每份
DNA
样品均能扩增出多态性丰富、
条带清晰的
DNA
片段
,
说明该
SRAP-PCR
反应体系
稳定可靠，适用于金花茶基因组
DNA
的
SRAP-PCR
扩增反应。
2
讨论
SRAP-PCR
反应受反应条件和扩增程序变化等
因素影响，此外，不同物种对反应条件的要求也存
在一定的差异。因此，对金花茶基因组
DNA
的