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孙传波等
, 2011,
农杆菌介法将耐盐基因
HAL1
转入玉米自交系
H99
的研究
,
分子植物育种
Vol.9 No.22 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0022)
1164
表
2
真空压力和侵染时间对玉米遗传转化的影响
Table 2 Effect of vacuum pressure and infection time on maize transformation
真空压力
(Mpa)
Vacuum pressure (Mpa)
抗性愈伤率
(%)
Freqency of resistant calli (%)
5 min
10 min
15 min
20 min
40 min
0
1.5
4.08
13.48
11.34
8.91
0.03
2.97
8.55
14.29
15.31
13.33
0.05
7.27
14.95
29.12
30.65
9.17
0.07
8.91
22
30.4
31.11
10.45
0.1
11.93
16.96
16.98
16.27
7.2
图
2
转基因植株
PCR
分析
Figure 2 PCR analysis on transgenic plants
注
: M: DL2000;
-
:
阴性对照
; +:
阳性对照
; 1
-
9:
转基因植株
Notes: M: DNA marker;
-
: Negative control; +: Positive control;
1
-
9: Transgenic plants
率高于其他条件，这说明此状态的愈伤组织刚好处
于对数生长期，比较利于转化。菌液浓度对转化频
率有着直接影响，当
OD
600
=0.6
时抗性愈伤率最高
为
35.33%
，但是当浓度过高时
(OD
600
＞
0.6)
，由于
吸附得菌液过多，对愈伤组织的伤害增大，后期的
抑制菌难度增加，转化率反而降低。在本实验中还
尝试了真空压力对遗传转化的影响，在
0.05 Mpa
和
0.07 Mpa
真空压力条件下，侵染
15 min
和
20 min
的抗性愈伤率几乎相同，但是发现同等压力条件
下，侵染时间长的难抑制菌，而且状态不好；相同
侵染时间时，真空压力越大越难抑制菌；综合考虑
选择
0.05 Mpa
真空压力，侵染
15 min
的转化条件。
因此选择继代
5 d
的愈伤组织、菌液浓度
OD
600
=0.6
和
0.05 Mpa
真空压力侵染时间
15 min
为目前本实
验室的玉米农杆菌转化的转化条件，要建立一套转
化效率高的完善体系，还需要研究影响遗传转化效
率的其他因素，我们将在以后的试验中继续优化。
通过该优化体系将耐盐基因
HAL1
转入玉米自
交系
H99
的愈伤组织
(1 260
块
)
中，经过
3 d
共培养，
4 d
恢复培养，三次除草剂
(Bar 3.0 mg/L)
筛选后，获得
转基因玉米材料
18
株，经过
PCR
初步鉴定，其中
9
株呈阳性，抗性植株阳性率为
50%
，初步证明外源
基因
HAL1
已经整合到玉米基因组中。转
HAL1
植株
的获得将为玉米抗旱耐盐的新品系玉米品种培育
奠定良好的基础。
3
材料与方法
3.1
材料
3.1.1
植物材料
玉米自交系
H99
。
3.1.2
植物表达载体
植物载体为
pC3301
-
HAL1
，含有目的基因
HAL
和筛选标记基因
Bar
(
图
3)
。
图
3 pC3301
-
HAL1
载体结构简图
Figure 3 Schematic representation of pC3301
-
HAL1
vector
3.1.3
培养基
实验中所用到的培养基如下：
YEP
培养基：酵
母提取物
10 g/L+
蛋白胨
10 g/L+NaCl 5 g/L
，
pH=7.0
；
侵染培养基：
1/2 MS
大量，
1/2 MS
微量，
1/2 MS
维生素，
100 mg/L
肌醇，水解酪蛋白
500 mg/L
，
2,4
-
D 1.5 mg/L AS100 mg/L+3.6%
蔗糖
+6.8%
葡萄
糖，
pH=5.2
；愈伤组织诱导培养基：
MS
大量，
MS
微量，
MS
维生素，
100 mg/L
肌醇，水解酪蛋白
500
mg/L
，
L
-
脯氨酸
500 mg/L
，
L
-
天门冬酰胺
200 mg/L
，
泛酸钙
0.5 mg/L
，生物素
0.05 mg/L
，
2,4
-
D 1.5 mg/L
，
蔗糖
4% (w/v) pH=6.0
；继代培养基：
MS
大量，
MS
微量，
MS
维生素，
100 mg/L
肌醇，水解酪蛋白
500 mg/L
，
2.4
-
D 2.0mg/L
，蔗糖
3% (w/v) pH=6.0
；