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水生生物研究, 2012 年, 第 1 卷, 第 7-13 页
Shuisheng Shengwu Yanjiu, 2012, Vol.1, 7-13
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族成员共有的蛋白稳定性及高导热性直接相关
(Muller et al., 2002; Barth et al., 2003)。
与哺乳动物相比，虹鳟鱼、大西洋鲑鱼、罗非
鱼和石鮨鱼等硬骨鱼类的 myostatin 基因有两种类
型(即 myostatin-I 和 myostatin-II) (Østbye et al., 2001;
Rodgers et al., 2003; Garikipati et al., 2007)。本实验
克隆的 myostatin 基因与这些鱼类的 myostatin-I 同
源性较高，而斑鳜中是否有第二种 myostatin 基因
类型的存在还有待进一步研究。许多研究表明：
myostatin 基因是哺乳动物肌肉发育中重要的负性
调控因子，仅在骨骼肌中特异性表达；而鱼类的
myostatin 基因在除骨骼肌外的多种组织(如: 脑, 心,
肾, 眼 , 肠等 ) 中广泛表达，因此，可推测鱼类
myostatin 基因的作用可能不仅仅局限于抑制其肌
肉的生长发育，还可对鱼类神经系统的发育等多方
面产生广泛影响(Garikipati et al., 2007)。本研究对斑
鳜 myostatin 基因及启动子进行了克隆及初步的生
物信息学分析，为进一步研究斑鳜 myostatin 基因
的功能及其启动子的调节机制提供了有益的参考。
3 材料与方法
3.1 试验材料和试剂
鲜活斑鳜(Siniperca scherzeri)购于长沙西长街
特种水产品市场，解剖获取鱼背部肌肉，提取基因
组 DNA 用于 myostatin 的克隆。
OMEGAMini Plasmid Kit、Gel Extraction Kit、
TaKaRa TaqTM PCR 试剂盒(购自宝生物有限公司)；
DNA mark、PMD18-T 载体、top10 感受态细胞(购
自天根生化科技有限公司)。
3.2 白肌基因组 DNA 的提取
称取 0.2 g 斑鳜的白肌，尽量剪碎，加入 1 mL
裂解液 (10 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0; 100 mmol/ L
EDTA; 400 mmol/L NaCl; 1% SDS)于玻璃匀浆器
中研磨均匀。吸取 500 μL 匀浆液，加入半粒黄豆
大的蛋白酶 K，摇匀，56℃消化 2~3 h。裂解物分
别用等体积的饱和酚、酚 /氯仿 / 异戊醇 (25:24:1)
和氯仿 /异戊醇(24:1) 各抽提 1 次， 12 000 r/min
离心 10 min，取上清液。加 1/10 体积 3 mol/L
NaAc 和两倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀 30 min，
12 000 r/min ，离心 10 min ，弃上清。70% 乙醇漂
洗两次，离心，弃废液，干燥。最后用 100 μL 无
菌去离子水溶解。
3.3 引物设计和合成
根据 Genbank 中与斑鳜亲缘性较近物种的
myostatin 基因序列的比较，设计简并引物AD1和特
异性引物Sp1 、Sp2及Sp3扩增斑鳜myostatin 的启动
子。引物F1和R1 ，F2和R2用于扩增 MSTN基因的部
分序列，再拼接成一个长片段。所用的引物 (表1)
均由博尚生物公司合成。
3.4 Myostatin 基因和启动子的克隆
AD1为14 bp的简并引物，以斑鳜白肌基因组
DNA为模板与下游引物SP1进行第一轮扩增，然后
以1 μL第一轮产物为模板与下游引物SP2进行第二
轮扩增，最后以 1 μL第二轮产物继续与下游引物
SP3进行第三轮扩增，得到第三轮产物 (PCR程序如
表2)。以斑鳜基因组DNA为模板，F1和R1 为引物进
行扩增，程序为94℃ 3 min；94℃ 30 s，56℃ 1 min，
72℃ 2 min，36个循环；72 ℃ 8 min。以F2和R2为
引物，斑鳜基因组DNA为模板进行PCR扩增，程序
为 94 ℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 1 min ，72℃ 1
min ，36个循环；72℃ 8 min。
表 1 引物序列及退火温度
Table 1 Nucleotide sequences and annealing temperature of oligonucleotide primers
引物 引物序列(5´–3´) 退火温度(℃)
Primer Nucleotides sequence (5´–3´) Annealing temperature (℃)
AD1 CGATGGCRCYRTCN 42
SP1 CATTATTGTCTCCGTGATGGCA 60
SP2 CTGGTGCGTCTCTTGGTCAC 58
SP3 GTTTGGATTAATGTCCCACAC 58
F1 AGACAATGCATCTCTCTCAGAT 56
R1 CTTCACCTCCATGAATGGTTG 56
F2 ACTGGGGCATCGAGATTAACG 58
R2 CAACTCAAGAGCATCCACAACG 58